مرکز جامع اوتیسم Comprehensive Autism Center

• رشته  DNA از توالی پشت سر هم از چهار نوکلئوتید آدنین (A) گوانین (G) سیتوزین(C)  و تیمین (T) تشکیل می شود. رشته  DNA  در انسان در یک سلول در 23 جفت قطعه بصورت جدا از هم بنام کروموزوم با طولهای مختلف قرار می گیرد. هر کروموزوم دارای چند صد تا چند هزار ژن می باشد.

•  
• تعداد ژنهای کد کننده پروتئین در انسان در حدود 20000
• اجزای اصلی ساختمان ژن طبق شکل زیر شامل:
  • پروموتر: جایگاه اتصال عوامل رونویسی جهت شروع رونویسی
  • UTR= Untranslated region : توالی قبل از اگزون اول و بعد از اگزون اخر (نواحی به رنگ قرمز در شکل ذیل)  که نسخه برداری میشود ولی به پروتئین ترجمه نمی شود.
  • اگزون: قطعه های توالی های کوتاهی در ژن که در RNA بالغ قرار گرفته و به پروتئین ترجمه می شود.
  • اینترون: توالی های بینابین اگزونها که در RNA اولیه قرار دارد ولی در روند پیرایش RNA (Splising)  حذف شده و در نهایت به پروتئین ترجمه نمی شود.
  •  

• Codon: هر اسید امینه در رشته پروتئین توسط سه نوکلئوتید پشت سر هم کد می شود که به این سه نوکلئوتید یک کدون گفته می شود. در مجموع 64 کدون و 20 اسید امینه در انسان وجود دارد. از 64 کدون 61 کدون نقش کد کننده اسید امینه، یک کدون نقش علامت اغازگر ترجمه و دو کدون نقش علامت پایان ترجمه  (Stop codon) را دارند. در نتیجه برخی از اسیدهای امینه توسط بیش از یک کدون کد می شوند. (شکل 3)
•  

• Noncoding RNA: بخشیهایی از توالی  DNA به RNA نسخه برداری می شود ولی این RNA ها به پروتئین ترجمه نمی­شوند و خود مستقیما در فعل و انفعالات داخل سلول ایفای نقش می­کنند. این نوع RNA ها بنام غیر کد کننده  (Noncoding RNA) شناخته می شوند. در حدود ده هزار ژن از این نوع وجود دارد. دسته بندی این نوع ژنها در شکل 4 آورده شده است.

• اپی ژنتیک (Epigenetic): با وجودی که در تمام انواع سلولهای بدن کپی یکسانی از DNA که شامل تمام توالی DNA می شود، وجود دارد و در واقع تمام ژنها در تمام سلولها وجود دارند ولی در هر سلولی بر اساس نوع سلول که در روند رشد جنین تا انسان بالغ تمایز یافته است، ژنهای خاصی بصورت ثابت روشن یا خاموش هستند و به اصطلاح بیان می شوند و یا بیان نمی شوند. خاموش و یا روشن شدن ثابت یک ژن توسط مکانیسمهای مولکولی صورت می گیرد که در مجموع اپی ژنتیک نامیده می شود. اپی ژنتیک در 4 سطح عمل میکند: در سطح رشته  DNA از طریق متیلاسیون (اضافه شدن گروه متیل ) نوکلئوتید ها که باعث خاموشی ژن می گردد. در سطح هیستونها ( پروتئین های بسته بندی کننده (DNA از طریق اضافه یا حذف شدن گروه استیل از اسیدامینه های خاص پروتئینهای هیستونی ( شکل 5)، در سطح  RNA از طریق تولید  RNA های غیر کد کننده که باعث تخریب یا غیر فعال شدن  RNA کد کننده می گردد و در سطح پروتئین از طریق مهار ترجمه و یا تخریب پروتئین تولید شده انجام میگیرد.           

• تفاوت جهش و واریانت:

• انواع واریانتها:
  • SNV: (Single nucleotide variant)  واریانت از نوع تغییر یک نوکلئوتید ( شکل شماره 6)
  • SNP: (Single nucleotide polymorphism) تغییرات تک نوکلئوتیدی نوکلئوتیدی که از نظر شیوع در جامعه بیش از یک درصد باشد.
  • Insertion: ورود یک یا حداکثر 50 نوکلئوتید یا رشته­ای از توای DNA در یک ناحیه از رشته DNA
  • Deletion: حذف یک یا حداکثر 50 نوکلئوتید یا رشته­ای از توالی DNA در یک ناحیه از رشته DNA
  • Indel: حذف و به طور همزمان ورود حداکثر 50 نوکلئوتید یا رشته­ای از توای DNA در یک ناحیه از رشته DNA
  • Structural variant: ورود و یا حذف های به طول بیش از 50 نوکلئوتید
  • CNV (Copy number variant): افزایش یا کاهش تعداد کپی توالی از DNA به طول بیش از 50 نوکلئوتید یا چند ملیون نوکلئوتید. نواحی­ای که یک کپی داشته باشند که شامل اکثر نواحی DNA  میگردد نیز در صورت حذف شدن که در نتیجه آن هیچ کپی­ای از آن وجود نخواهد داشت، نیز به عنوان CNV محسوب میگردد. در واقع تعریف CNV با تعریف Structural variant همپوشانی زیادی دارد.

• Dynamic mutation: جهشهایی هستند که در آن طول یک قطعه ای از DNA که دارای توالی تکراری پشت سر هم  از چند نوکلئوتید ( 2 تا 10 نوکلئوتید) در هر نسل در اثر افزایش تعداد تکرارها، افزایش می­یابد. این اتفاق در اثر لغزیدن کمپلکس پروتیئینی کپی کننده DNA به عقب یا جلو در اثر خطا بدلیل توالی های تکراری پشت سرم هم ایجاد میشود. این نوع واریانتها بیشتر باعث ایجاد اختلالات نورولوژیک می شود. (شکل 7)

• دسته بندی واریانتها از نظر آسیب زایی:

• آسیبزا (Pathogenic): بطور قطعی آسیب زا می باشد
• احتمالا آسیبزا  (Likely Pathogenic): با احتمال بالای 90 درصد آسیبزا می باشد
• ناشناخته (Variant of uncertain significance= VUS): در حال حاضر آسیبزا بودن یا نبودن قابل ارزیابی نیست.
• احتمالا خوش خیم (Likely benign): با احتمال 90 درصد خوش خیم است.
• خوش خیم (Benign): واریانت خوش خیم.

• انواع اختلالات و توارث انها:
  • اختلالات تک ژنی = توراث مندلی شامل:
    • توارث اتوزومی غالب
    • توارث اتوزومی مغلوب
    • توارث وابسته به ایکس غالب
    • توارث وابسته به ایکس مغلوب
    • توارث هولاندریک ( وابسته به کروموزوم (Y  توارث پدر به تمام فرزندان پسر.
  • اختلالات دو ژنی: دو ژن هم زمان بصورت غالب یا مغلوب باید دارای واریانت پاتوژنیک باشند.
  • اختلالات چند ژنی: اثر هم افزایی ورایانتهای پاتوژنیک چند ژن باعث ایجاد بیماری می گردد.
  • اختلالات چند عاملی: اثر هم افزایی واریانتهای پاتوژن چندین ژن به همراه عوامل محیطی باعث ایجاد بیماری میگردد. مانند دیابت، افزایش فشار خون، افزایش چربی خون، اکثر اختلالات روانپزشکی.

• اختلالات میتوکندریای: در اثر واریانتهای پاتوژنیک در DNA  میتوکندریایی ایجاد میگردد. با توجه به اینکه میتوکندری فقط از طریق تخمک از مادر انتقال می یابد این نوع اختلالات فقط توراث مادری به تمام فرزندان دارد.

• همچنان که در نمودار D در شکل شماره 8 ملاحظه می گردد، با افزایش تعداد ژنهای دخیل بصورت هم زمان در یک اختلال، نمودار در یک طیف حالت منحی توزیع نرمال پیدا میکند. یعنی با حرکت به سمت راست نمودار میزان خطر ابتلا افزایش پیدا میکند. در بیشتر اختلالات چند عاملی و چند ژنی با وجود افزایش عوامل ریسک بصورت یک طیف، بروز یا عدم بروز بیماری در یک نقطه خاصی بصورت صفر یا یک اتفاق می افتد. یعنی فرد یا بیمار میشود و یا نمی شود. این وضعیت که مدل آستانه نام دارد در شکل شماره 9 نمایش داده شده است. یعنی با رسیدن مجموع عوامل خطر به یک آستانه خاص، بیماری بروز پیدا میکند. اکثر اختلالات روانپزشکی نیز از این اصل پیروی میکند.

• انواع تستهای ژنتیک، ویژگی و کاربرد:
  • کاریوتایپ (Karyotype): بررسی حذف  و اضافه تعدادی و یا ساختاری در کروموزمها که زیر میکروسکوپ با چشم قابل مشاهده باشد.
    • معمولا تغییرات به طول حداقل 5 ملیون باز قابل شناسایی است.
    • کل ژنوم بررسی میشود.
    • نیاز به ناحیه کاندید ندارد.
    • جابجایی های متعادل و نامتعادل قابل شناسایی است.
    • وارونگی کروموزم قابل شناسایی است.
    • نیاز به سلول زنده و کشت سلول دارد.
    • جهت بررسی اکثر اختلات شدید ژنتیک با علائم متعدد و نیز اختلال ذهنی بدون سایر علائم بکار می رود.

• Array CGH: بررسی حذف  و اضافه تعدادی و یا ساختاری در کروموزمها با روش مولکولی ( بدون مشاهده مستقیم با میکروسکوپ:
  • معمولا تغییرات به طول حداقل پنجاه هزار باز قابل شناسایی است.
  • کل ژنوم بررسی میشود.
  • نیاز به ناحیه کاندید ندارد.
  • جابجایی های متعادل قابل شناسایی نیست.
  • وارونگی کروموزم قابل شناسایی نیست.
  • نیاز به سلول زنده و کشت سلول ندارد.
  • جهت بررسی اکثر اختلات شدید ژنتیک با علائم متعدد و نیز اختلال ذهنی بدون سایر علائم بکار می رود.

• فقط امکان تشخیص حذف یا اضافه شدن یک توالی خاصی از DNA که از طریق پروب ( قطعه کوچکی از رشته DNA به طول حدود 150 تا 1000 باز( را دارد.
• نیاز به ناحیه کاندید دارد.
• جابجایی های متعادل قابل شناسایی نیست.
• وارونگی کروموزم قابل شناسایی نیست.
• نیاز به سلول زنده و کشت سلول ندارد.
• جهت بررسی حذف یا اضافه شدگی هایی که از قبل شناسایی شده و یا حذف و اضافه شدگی های کروموزم مشخصی، بکار می رود. در این روش طول ناحیه حذف یا اضافه شده قابل تشخیص نیست. فقط نشان میدهد که قطعه هدف در ژنوم وجود دارد یا خیر یا به چه تعداد وجود دارد.

• Sanger Sequencing: بررسی توالی نوکلئوتیدهای یک رشته به طول 100 الی 800 نوکلئوتید
  • بررسی ناحیه کاندید شده.
  • جهت تشخیص تغییرات تک  و یا چند نوکلئوتیدی 

• MLPA= Multiplex-ligation dependent probe amplification:  بررسی حذف  و اضافه تعدادی و یا ساختاری در کروموزمها و یا توالی ای از DNA با روش مولکولی. از نظر کاربردی تا حد زیادی شبیه تکنیک FISH می باشد. ولی روش تکنیک کاملا متفاوت بوده و آسانتر و با هزینه کمتر قابل انجام است.
  • فقط امکان تشخیص حذف یا اضافه شدن یک توالی خاصی از DNA
  • ناحیه کاندید شده بررسی میشود.
  • نیاز به ناحیه کاندید دارد.
  • جابجایی های متعادل قابل شناسایی نیست.
  • وارونگی کروموزم قابل شناسایی نیست.
  • نیاز به سلول زنده و کشت سلول ندارد.
  • جهت بررسی حذف یا اضافه شدگی هایی که از قبل شناسایی شده و یا حذف و اضافه شدگی های کروموزم مشخصی، بکار می رود. در این روش طول ناحیه حذف یا اضافه شده قابل تشخیص نیست. فقط نشان میدهد که قطعه هدف در ژنوم وجود دارد یا خیر و یا به چه تعداد وجود دارد.

• WES=Whole Exome Sequencing: در این روش با استفاده از تکنیک NGS (Next generation sequencing) تمام اگزونها در تمام ژنها در یک تست تعیین توالی میگردد. اگزونها 1.5 درصد کل توالی ژنوم (کل توالی DNA سلول) را شامل می شوند که جهشهای این 1.5  درصد عامل  85 درصد از اختلالات ژنتیک می باشد. این تست با وجود قابلیتهای فراوان محدودیتهایی نیز دارد:
  • اگر واریانت عامل در نواحی اینترونیک با فاصله بیشتر از انتهای اگزون قرار گرفته باشد تعیین توالی نخوهد شد.
  • تست WES  دقت پایینی در تشخیص واریانتهای CNV  دارد.
  • تست WES  دقت پایینی در تشخیص واریانت از نوع تکرارهای چند نوکلئوتیدی (Repeat expansion ) دارد.
  • اختلالات کروموزمی متعادل از قبیل وارونگی و یا جابجایی متعادل قابل شناسایی نیست.
  • در حدود یک الی دو درصد از ژنهای شناخته شده در روش WES تعیین توالی نمی گردد.
  • در صورت عمق خوانش کم در توالی های هدف، میزان خطای تشخیص و موارد مثبت و منفی کاذب افزایش خواهد یافت.